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血管形成实验从原理到定量分析完美攻略

发布时间:2019-11-27 02:00 来源:永利国际402娱乐官网

  血管生成(Angiogenesis)是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管,其对于器官生长、胚胎发育和伤口愈合在内的多种过程十分重要。

  血管形成实验(Tube formation assay)是体外研究血管生成的经典方法,该方法可快速确定参与血管生成的基因或通路。今天给大家分享血管形成实验从原理、实验细节到定量分析的完美攻略!

  多种类型的内皮细胞均可用于本实验,包括原代细胞和永生化细胞系。常用的有人脐静脉内皮细胞(HUVEC),之所以不采用静脉血管内皮细胞与动脉血管内皮细胞是因为HUVEC具有干细胞的潜能,理论上可以传代50-60次。

  此外小鼠3B-11细胞、小鼠SVEC4-10细胞或原代内皮细胞也可用于血管形成实验。

  (1)以3B-11细胞为例,检测前两天将3B-11细胞传代。细胞传代次数很重要,当细胞在第2代和第6代之间时,血管形成效果最好。使用第2代之前或第10代之后内皮细胞会影响实验效果:

  值得注意的是BME浓度因批次而变化很大。如果浓度低于10mg/ml,BME就不能很好工作,因此应该在购买之前联系代理商,以确保获得足够集中批次的试剂。

  (2)BME小瓶使用前一天浸入置于4度冰箱的冰中过夜解冻,解冻后,旋转小瓶以确保混匀。融化后的基质胶在15℃以上,会迅速凝固,操作的时候放置在冰上,防止过早凝固。

  此外,与基质胶接触的所有培养器皿、耗材和培养液均应预冷,整个实验过程需始终保持基质胶置于冰上。对融化后的基质胶进行分装,需用预冷的冻存管,迅速冷冻并保存,避免多次冻融。

  (3)用于信号通路研究时,低生长因子的BME(Reduced growth factor BME)比起传统的BME更可取,因为排除了生长因子的干扰。

  (1)使用杜氏磷酸缓冲液(DPBS,和常用标准PBS区别是不含钙、镁离子)清洗3B-11细胞,加入适量含EDTA胰蛋白酶消化细胞。

  (3)在含10% FBS,2mM L-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中计数细胞至最终浓度7.5x106个细胞/ml。402com永利手机版所种细胞数也会影响血管形成效果,不同细胞类型密度需摸索:

  (1)将24孔板和1ml枪头放在冰箱或冰上20-30分钟后再使用,这样BME就不会过早固化。

  (2)将250µl低生长因子的BME加入24孔板中,移液过程中避免产生气泡,确保胶完全覆盖孔底。

  (4)将大约300µl的培养基与10µl重悬的3B-11细胞(约75,000细胞)混合。根据使用的内皮细胞类型调整培养基的体积和细胞数,例如HUVEC 96孔板每孔细胞数约2-3x104个。

  (5)Tubes将在2-4小时内开始形成,这取决于培养基中血管生成因子的浓度,小管形成的峰值可能发生在3到12小时之间,并且需要优化检测的时间。如果使用原代内皮细胞而非永生化细胞,开始成管的时间会延迟几个小时。一般而言成管会在18小时内开始恶化,内皮细胞将发生凋亡:

  (6)在血管形成的最佳时间小心去除培养基,避免破坏BME上的血管网络。使用1ml DPBS洗涤后加入1ml新鲜DPBS,使用倒置显微镜或荧光/共聚焦显微镜(如果细胞被Calcein AM染色)对管状网络进行成像。当然也可使用4%的多聚甲醛室温固定15min后进行成像。

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